Méthodes et protocole

Remarque préliminaire : Sauf mention contraire, toutes les manipulations décrites ci-dessous doivent impérativement être effectuées sous hotte à flux laminaire avec du matériel stérile.

1) Culture cellulaire et repiquage

a) Matériel
– matrice de Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium D5796
– 5 % (en volume) de sérum de veau foetal
– 1 % d’antibiotiques
– trypsine

b) Préparation du milieu de culture
– Dans un falcon de 50 mL, insérer 4×10 mL de matrice
– Ajouter 2 mL de sérum
– Ajouter 400 µL d’antibiotiques
– Bien homogénéiser et conserver au réfrigérateur à 4 °C.

c) Repiquage d’une boîte de culture
– Chauffer le milieu au bain-marie à 37 °C
– Retirer le milieu de la boîte de culture initiale
– Ajouter 5 mL de trypsine et replacer la boîte dans l’incubateur pendant une durée de 7 à 10 minutes
– Quand suffisamment de cellules sont en suspension (à vérifier de temps en temps au microscope ; agiter légèrement la boîte si nécessaire), transvaser le contenant dans un falcon de 15 mL
– Ajouter 5 mL de milieu de culture. Homogénéiser.
– Prélever 100 µL et les injecter dans une nouvelle boîte de culture
– Ajouter 10 mL de milieu de culture et replacer la boîte dans l’incubateur.

Le reste du falcon peut-être redilué au 1/10 avec du milieu et utilisé pour ensemencer les pochoirs, ou jeté. Le milieu de la culture cellulaire doit être changé tous les 3 à 4 jours selon la quantité de cellules repiquées et les horaires d’accessibilité.

Remarque : Les MDCK étant assez résistantes à la trypsine, une simple dilution est ici suffisante pour dissiper ses effets. Il n’est pas nécessaire de les centrifuger comme cela se fait souvent pour d’autres lignées cellulaires.

d) Paramètres de l’incubateur
– Température 37 °C
– Atmosphère à 5% CO2
– Pression de vapeur saturante en H2O. Toujours s’assurer que le plateau dans l’incubateur est rempli d’eau.

2) Les pochoirs et l’enregistrement des migrations

a) Description du montage

– Les pochoirs utilisés pour simuler la cicatrisation cellulaire sont de la marque Ibidi. Ils sont fournis directement fixés sur une boîte de Pétri traitée pour favoriser la migration cellulaire.

– L’enregistrement se fait dans l’incubateur avec une caméra électronique de la marque Dino-Lite montée sur un support élévateur spécialement prévu à cet effet. Elle est reliée à l’ordinateur via son câble qui peut être scotché sur l’incubateur pour limiter les perturbations des enregistrements lorsque la porte est ouverte/fermée. Le logiciel d’acquisition (« Dinocapture ») peut être installé à partir du CD fourni avec la caméra.

– Ce logiciel permet de prendre de simples photos, ou d’enregistrer des vidéos en indiquant la durée d’acquisition ainsi que la fréquence des prises de vues. Le film peut être mis en pause ou arrêté à tout moment. S’il est nécessaire d’éteindre la diode entre chaque prise de vue (pour éviter le photobleaching lorsqu’on travaille avec des fluorophores par exemples), il faut cocher la case « Turn off between … ».

Important : NE JAMAIS ESSAYER DE LIRE UNE VIDÉO EN COURS D’AQUISITION QUI A ETE MIS EN PAUSE, CELA FAIT PLANTER LE LOGICIEL ET ENTRAINE LA PERTE DE LA VIDEO.

b) Protocole

– Soigneusement remplir à ras-bord chaque puit du pochoir avec le mélange cellulaire de repiquage dilué
– Placer le pochoir à l’incubateur pendant 2 jours
– Quand les bancs cellulaires sont à confluence (à vérifier au microscope), retirer le moule en silicone
– Si nécessaire, flusher la boîte pour bien nettoyer le tissu cellulaire
– Verser quelques mL de milieu de culture dans la boîte de Pétri de façon à la remplir aux 3/4
– Placer la boîte dans l’incubateur et jouer sur les réglages de la caméra (translation du support puis réglage fin via la molette) pour obtenir une mise au point satisfaisante.
– Fermer l’incubateur et lancer l’acquisition. La cicatrisation complète des cellules nécessite entre 2 et 3 jours.

Commentaire : Nous avons tenté à plusieurs reprises de réutiliser des pochoirs usés en les stérilisant, puis en tentant de les refixer sur un boîte de Petri. Mais toutes nos tentatives ont échoué car le manque de matériel permettant de stériliser efficacement nos outils faisaient que les pochoirs finissaient toujours par être contaminés.

3) Traitement à la latrunculine

La latrunculine que nous étions procurée était à 6 mM dans du DMSO (à conserver au congélateur).

– Dans un falcon de 15 mL, insérer 1 µL de latrunculine.
– Diluer en ajoutant 1,5 mL de milieu de culture pour obtenir une solution à 4 µM (dilution 1/1500). La solution ainsi préparée doit immédiatement être utilisée.
– Lorsque le pochoir est à confluence, retirer le milieu de culture et remplir les puits avec la solution de latrunculine diluée.
– Laisser incuber pendant 2 h.
– Retirer la latrunculine, enlever le pochoir et remplir la boîte de pétri avec du milieu de culture.
– Enregistrer la migration comme précédement.

Remarque : le facteur de diluton est à adapter selon le type de cellules et l’effet voulu. La gamme de concentrations préconisées varie entre 2 et 10 µM.

4) Marquage fluorescent des noyaux

Nous nous étions procuré 5 traceurs différents (numérotés 80 à 85) et avons opté pour le n°80, car sa longueur d’onde d’absorption était la plus proche de la longueur d’onde d’émission de notre caméra fluorescente. Le traceur était fourni en solution dans le DMSO à 5 mM pour un volume de 50 µL.

– Dans un falcon de 15 mL, diluer le traceur fluorescent à 1/1000 (2 µL dans 2 mL) avec du milieu de culture pour obtenir une solution à 5 µM (concentration préconisée par le fabriquant pour les cellules de mammifères).

– Lorsque le pochoir est à confluence, retirer le milieu et remplir les puits avec ce mélange.

– Laisser incuber. Selon le fabriquant, la durée d’incubation peut varier d’une dizaine de minutes à 2 h. Vérifier de temps à autre avec la caméra fluo que les noyaux absorbent bien le traceur. Lors de nos deux tentatives, nous avons laissé incuber 1 h et le contraste obtenu était très satisfaisant.

– Retirer le traceur, enlever le pochoir puis remplir la boîte de Petri avec du milieu de culture en flushant si nécessaire.

– Enregistrer la migration en prenant garde de désactiver la diode de la caméra fluorescente entre chaque prise de vue.

Remarque : l’option « Eteindre la diode entre les prises de vue » du logiciel n’a pas bien fonctionné pour nous car le film obtenu était intégralement noir. Il semblerait que, lorsque cette option est cochée, le logiciel allume la diode 5 secondes avant la prise de vue, mais l’éteint juste avant que la caméra prenne la photo. Nous n’avons pas eu le temps de vérifier si ce problème venait d’une erreur de programmation interne ou d’un paramétrage manuel dysfonctionnel. C’est une affaire qu’il reste encore à élucider…

5) Marquage immunofluorescent (IF) de la tubuline

a) Matériel
– PBS
– PFA (4 % dans PBS)
– Triton X-100 (0,1 % dans PBS)
– Solution de bloquage (BSA à 1 % dans PBS)
– Anticorps primaire (anti-tubuline) et secondaire

b) Protocole

– Quand les deux bandes de cellules sont au stade de cicatrisation voulu, retirer le milieu et rincer 1 fois rapidement au PBS.
– Fixer les cellules pendant 15 min avec le PFA.
– Rincer 3 x 10 min au PBS.
– Perméabiliser les cellules avec le Triton X-100 pendant 10 min.
– Rincer 3 x 10 min au PBS.
– Bloquer les cellules pendant 1 heure dans le BSA. Le blocage peut être prolongé si nécessaire*.
– Incuber pendant 45 min avec l’anticorps primaire.
– Rincer 3 x 10 min au PBS (*si le blocage a été prolongé, prolonger la durée des rinçages).
– Incuber pendant 30 min avec l’anticorps secondaire.
– Rincer 3 x 10 min au PBS. Conserver les cellules fixées dans quelques mL de PBS.
– Monter sur milieu de montage avec DAPI (si nécessaire).
– Observer au microscope à fluorescence à la longueur d’onde correspondant à l’anticorps secondaire.